| 发布日期：2025-01-11 16:56 点击次数：200 |
肌肉外伤割断周围神经后，统统重新主管可能需要数年时分。在此时期，失去神经主管的肌肉会萎缩并失去乙酰胆碱受体（神经肌肉接头的紧迫构成部分），从而死字了功能的规复。临床上颐养肌肉萎缩的常用方法之一是电刺激，但刻下使用的附膜电极体积浩大，况且时时会因过度炎症反应而失效。此外，仍然需要一种能在体内监测神经肌肉再生和乙酰胆碱受体防守情况的安装。在此，咱们开发了一种可植入的柔性微电极阵列（MEA），它能在永远神经主管经过中提供名义神经肌肉刺激和纪录。
MEA 使用柔性聚酰亚胺弹性体和具有 Peano 曲线图案的金基微电极阵列，共同保握电极的柔性。这些安装被植入 5 只大鼠的去神经主管腓肠肌。这些大鼠从术后第 2 天启动每天接受 MEA 颐养性刺激。另外 5 只大鼠接受了胫神经切除术，但莫得植入 MEA。术后第 14 天得益组织，并使用免疫荧光和组织学染色对乙酰胆碱受体和肌纤维面积进行量化评估。该安装植入大鼠体内后告成纪录了肌电图数据。与未经颐养的去神经主管肌肉比拟，MEA疗法通过防守更大的肌肉纤维横截面积，松开了肌肉萎缩（p < 0.05）。这项认识考证职责告成解说了将适形性、抗拉强度增强金属微图案化、电刺激和纪录结合到功能性植入物中的才略，该植入物既可用于附肌刺激，也可用于纪录。
一、筹商简介
伸开剩余93%硅是统统电子产物的基本平台，自 1947 年第一个晶体管问世以来，硅的刚性一直谢却着竖立仿生学的发展。坚韧电极与软组织之间的机械不匹配会导致植入部位出现荟萃性炎症。由此产生的纤维组织可能会将安装与基层组织阻碍开来，从而死字电流在纪录和刺激经过中的灵验传输。理念念的电极应由柔性材料构成，这种材料对拉伸具有低模量反映，可产生更大的弹性变形，并能使挪动组织与电极精细战争。柔性电子产物已被开发用于电子皮肤、电子纺织品和柔性太阳能电板 。这类产物由千里积在团聚物基底上的金属膜构成。硅、聚酰亚胺（PI）、SU-88、对二甲苯C9 和聚二甲基硅氧烷（PDMS）10 的杨氏模量离别约为 25.5 GPa、8.45 GPa、5.6 GPa、4.0 GPa 和 1.0 MPa。因此，与硅基电极比拟，使用团聚物基底的电极对组织的毁伤较小。之是以礼聘 PI 行为基底，是因为它具有多种风景和相对和缓的异物反应，这两点对于可拆卸、非永远性植入物相称有用。这种材料已被平凡用于神经名义界面。科学家联想了在厚度约为 12 μm 的 PI 基底上制造的带有金碳纳米管的 C 形袖带电极，以最小的战争创建神经-电极界面，从而减少神经毁伤。
诚然这些聚酰亚胺电极具有柔韧性，但其局限性在于行为导电层镶嵌聚酰亚胺基底的金属元件（包括金、不锈钢、铂、钛和铱）会产生硬化效应。在最近的一项筹商中，硬金属线被联想身分形图案（图 1A 和 1B），并粘合到弹性体上以提升伸展性。Peano 曲线是一种连气儿且充满空间的分形曲线。这种联想可用于微电子布线，并提供多轴辅助。图 1C 所示的这种 Peano 图案变化被用于咱们开辟的布线，将战争垫流通到源平台（图 1D）。
图 1：（A）分形图案的基本元素。(B) 用曲线代替了硬边，形成概括。(C) Peano 曲线变化自满了具有拉伸强度的硬金属萍踪。(D）电极阵列皮纳曲线。(E) 柔性微电极阵列（MEA），包括一个 1 厘米乘 1 厘米大小的源平台。(F) 金培诺曲线电极的扫描电子显微镜图像。(G) 开辟组件暗示图。
植入式微电极阵列（MEA）的开发是为了在周围神经毁伤后对肌肉进行电刺激，在这种情况下，骨骼肌的神经被割断并发生沃勒变性。被割断的神经以每天 2-3 毫米的速率再生，大致需要一年时分才调愈合。即使对周围神经毁伤进行了最好的药物和手术颐养，肌肉功能也只可得到部分规复。这种不统统规复是由于神经肌肉接头（NMJ）的解体导致再生神经无法建立适合的肌肉-神经界面。NMJ 由三个部分构成，包括贯通轴突结尾、结尾许旺细胞和含有乙酰胆碱受体（AChR）的肌纤维终板。周围神经毁伤一周后，乙酰胆碱受体簇会分散，乙酰胆碱受体的盘活时分责怪十倍，导致可用于再主管的乙酰胆碱受体数目昭彰减少。因此，再神经主管只可规复有限的功能。
在此，咱们将先容咱们怎么勤勉联想一种安装来防守肌肉萎缩和乙酰胆碱受体降解，以改善后续的再神经主管并责怪康复时分。为了更好地将电子器件与东说念主体柔嫩的骨骼肌组织相结合，咱们开发了三种主要方法。当先，将金线印在一层柔性生物相容性材料 PI 上，制成弹性电路板。除了提供电气平台，聚酰亚胺材料还能起到电绝缘作用（图 1E 和 1G）。其次，两个电极以并列平行的时事重新陈设，不错适合周折的名义。临了，受大当然的启发，电路布线被重新联想身分形模式，允好多向拉伸。
二、筹商材料与方法
2.1 MEA 的制造
图 S1 陈说了器件制造经过的纲目。制造经过从直径 100 毫米的无尘硅片（测试 N 型，<100>）启动，该硅片被用作制造平台。2) 在平台上以 5000 rpm 的转速旋涂一层 200 nm 的聚甲基丙烯酸甲酯，握续 60 秒。4) 使用电子束千里积法在平台上千里积 10 纳米钛（Ti）附着层和 500 纳米金（Au）层。5) 在平台上旋涂一层 6 μm 的 Microposit s1813 光刻胶，转速为 1,500 rpm，时分为 30 秒，然后在 100° C 下固化 3 小时。7) 使用碘化钾溶液蚀刻金层 278 秒。将平台浸入酸性罩内的溶液中 280 秒。在酸性罩内使用 10:1:1 的去离子水/氟化氢/过氧化氢溶液对钛粘附层进行 10 秒钟的蚀刻。8) 以 2,700 rpm 的转速旋转涂覆 10 μm 的 PI 封装层 30 秒，然后在 250° C 下固化 2 小时。） 在反应离子蚀刻经过中，千里积 2 nm 的铝层以保护战争垫位置周围的聚酰亚胺。10) 在 5000 rpm 的转速下旋涂一层 6 μm 的 Microposit s1813 光阻 60 秒，然后在 100° C 下固化 3 小时。11) 铝层在 50 摄氏度的酸性罩中蚀刻 2 秒钟。12) 操纵 100% 氧气进行活性离子蚀刻。12) 其余的铝层在 50° C 的酸性罩中蚀刻 2 秒钟。13) 使用丙酮溶化 PMMA 底座，然后将安装从平台上拆下。然后将电极切割成 1 厘米乘 1 厘米的正方形。
2.2 手术植入
统统动物实验标准均按照好意思国陆军医学筹商和物质司令部（USAMRMC）筹商保护办公室（ORP）和麻省理工学院动物看护委员会（Committee on Animal Care of Massachusetts Institute of Technology）的动物看护和使用审查办公室（ACURO）的引导主见进行，实验对象为雌性 Lewis 大鼠（n = 10，年齿：14 周）。统统安装均在植入前用环氧乙烷灭菌，并至少脱气 24 小时。皮下打针以下剂量的退缩性镇痛药：布仑奈斯（0.03 毫克/千克）和好意思洛昔康（1.0 毫克/千克）。统统手术均在异氟醚（2.0%）/氧气吸入条目下进行。统统手术均在无菌环境中选择无菌时刻进行。平行于股骨切开一个 2 厘米的切口。通过股外侧肌和股二头肌进行钝性剥离，表露后窝内的坐骨神经。胫神经被细则为最大和最中心的分支。用虹膜剪刀尽可能向远端切除该神经（图 S8A），并在近端再进行不小于 1.5 厘米的锐性切除。从后窝取出 1.5-3 厘米的部分（图 S8B）。然后使用四针聚丙烯缝线将安装固定在腓肠肌上。流通 MEA 的导线穿过皮下纯正到达头皮切口。用牙科陶瓷将与线束结尾邻接的头架安装在头骨上。对动物进行监护，直到其规复清爽。术后 14 小时进行术后查验。手术后每隔8小时给动物打针一次布普利昔（0.03毫克/千克），用于止痛。好意思洛昔康（1.0毫克/千克）每24小时给药一次，握续48小时。动物在手术后14天安乐死。
2.3 组织学
手术 14 天后汇集组织样本。样本在磷酸盐缓冲液（PBS）中的 4% 福尔马林溶液中固定 24 小时。然后，将样本放入 70% 的酒精（用超纯密理博水行为稀释剂）中，并送至科赫筹商所组织学中枢，用石蜡固定。从每个石蜡块中取出厚度为 5 微米的多片腓肠肌轴向切片，固定在显微镜载玻片上，并用血红素和伊红（H&E）、梅森三色染色（MTS）和皮克天狼星红（PSR）染色，以分析肌肉纤维面积，并评估大体形态变化和胶原千里积。每个石蜡切片块中厚度为 5 µm 的其他轴向切片被固定，并用 Alexa-Flour 488 流通的 alpha bungarotoxin 染色，然后用 DAPI 反染。
2.4 体内功能性电刺激
通过板载无线蓝牙客户端的 rFDuino 微规章器（图 2a），电输入导线与 MEA 的输出导线邻接。咱们创建了一个 iPhone 应用标准，通过 Arduino 集成开发环境 (IDE) 代码规章振幅、频率和鉴识长度。操纵 Arduino 集成开发环境，咱们不详为功能性电刺激事先编程所需的参数，并将其上传到 rfDuino 微规章器。由于 rfDuino 由袖珍低功耗纽扣电板（CR2032 锂金属 3V 250mAh 纽扣电板）供电，因此不错启动 BLE 堆栈。咱们使用 XCode 系统将 iPhone 与 rfDuino 通过蓝牙配对；配对告成后，手机将充任规章器，规章微规章器的预编程参数。按下手机上的按钮后，二进制输入数据就会以无线神气发送到微规章器，微规章器就会按照所需的参数启动刺激标准。系统按设定的编程时分鉴识从低功耗纽扣电板中得到必要的电流，并将其输出到 MEA。rfDuino 与 MEA 之间的连线使用的是细长的医用不锈钢绞合线。电流通过 MEA，然后从与组织流通的小战争片中流出。
每年的七月初七，刘邦为戚夫人缠绕五色丝线，以此表达相怜爱，表达世世代代为夫妻。
公元前403年，魏，赵，韩脱离晋国，正式独立。这就是历史上的三家分晋，也是战国史的开端。作为此时魏国的君主，魏文侯首先进行了改革，迪士尼彩乐园应用下载发展经济，积累了大量的力量。
图 2：（A）刺激的握续时分、电压和频率由手机应用标准和带有蓝牙客户端的 rFDuino 微规章器规章。共有 10 只动物接受了胫神经毁伤手术，其中 5 只植入了电极。术后第 14 天（POD 14），得益腓肠肌进行组织学和免疫组化染色。(B) H&E 和梅森三色染色法（MTS）染色的肌肉纤维的 2 倍和 10 倍放大截面图：（1）未受刺激的去神经主管肌肉（上图，“去神经主管，无 MEA”）；（2）受 MEA 刺激的去神经主管肌肉的肌肉纤维（中图，“去神经主管 + MEA”）；（3）未受刺激的神经主管肌肉的肌肉纤维（下图，“对照组”）。C) 测量 “对照组”（左）、“去神经主管”（无 MEA，中）和 “去神经主管 + MEA”（右）的肌纤维横截面积。通过 Kruskal-Wallis 熟谙和 Dunn's 多重比较后熟谙，差错条数为 ± S.E.M.，* 线路 p < 0.05。在对照组（神经主管的腓肠肌）病例中，测量了 5 只动物的 1600 根纤维。在未受 MEA 刺激的 5 只腓肠肌去神经主管动物中，测量了 8 只动物的 1600 根纤维。对于 MEA 病例，从 5 只动物身上测量了 955 根纤维。肌肉纤维面积以自便单元（AU）线路。(D）未受刺激和受刺激肌肉的 AChR 平均面积。刺心理况下的面积昭彰更大。差错带为 ± S.E.M.，* 线路经曼-惠特尼熟谙 p < 0.05。在 5 只未受刺激的去神经主管腓肠肌动物中，共汇集了 3160 个读数。在 5 只接受 MEA 刺激的去神经主管腓肠肌动物中，共汇集了 2697 个读数。面积以自便单元（AU）陈说。
2.5 体表里膜纪录
用异氟醚（2%）/氧气吸入法麻醉一只 Lewis 大鼠。沿股骨长度的一半切开。在股外侧肌/股二头肌平原之间的脂肪垫处进行钝性剥离，表露坐骨神经。然后分离坐骨神经，用钩状神经刺激器将其抬起 2 厘米，以幸免与肌肉战争。
钩状神经电极流通到 S88X 型草刺激器上。草刺激器被建立为输出 400 毫秒的双相序列，每相脉冲宽度为 200 微秒。振幅扫描用于细则 MEA 是否不详通过增多每个脉冲序列的信号振幅来捕捉电信号的变化。纪录在三个连气儿的脉冲串上进行。来自刺激器的受控电流流向钩状神经电极，以刺激离体坐骨神经。MEA 开辟流通到 RHD2000 系列放大器评估系统（Intan Technologies），该系统可纪录多达 256 个低噪声放大器通说念的生物电位信号（图 3A）。MEA 被平放于股二头肌背侧名义，以便远离坐骨神经进行理念念的肌肉战争。此外，还在皮下插入了一个接地电极，以提供导电通说念。
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图 3. (A) MEA 开辟流通到 RHD2000 系列放大器评估系统（Intan Technologies）。RHD2000 芯片将 EMG 信号输出到策动机，在策动机上使用 MATLAB 对数据进行处分。MEA 平放在股二头肌名义的顶部，以便远离坐骨神经的理念念肌肉战争。肌肉内插入接地电极，为导电提供通说念。(B) 图中自满的是一只动物植入电极后立即进行的代表性肌电图，包括统统后处分风景，以展示 MEA 在顺利刺激坐骨神经时纪录三组脉冲刺激的才略。
2.6 统计分析
未对 H&E 图像或显微镜图像进行预处分。统统肌纤维横截面积数据（图 S3 和 S4）和乙酰胆碱受体面积数据（图 S5 和 S6）的 Q-Q 图自满为非正态溜达。Shapiro-Wilk 熟谙进一步证据了这种非高斯溜达。由于穷乏正态性，因此无法使用参数统计分析（即学生 t 熟谙和方差分析）。为了比较两个均值，使用了非参数孤苦组曼-惠特尼熟谙。若要比较两个以上的孤苦组，则选择非参数 Kruskal-Wallis 熟谙和 Dunn's 多重比较后熟谙。若是 p < 0.05，则以为互异具有统计学意旨。统计测试使用 GraphPad Prism 5.00 版和 R 3.4.3 版进行。
三、筹商收尾
3.1 柔性多电极阵列（MEA）的机械测试
还对 MEA 进行了机械测试，以细则其在模拟体内压力下的弹性特色。MEA 与基层肌肉和肌腱组织之间的模量匹配对于退缩植入创伤、微动毁伤和植入部位炎症引起的好多急性和慢性问题相称紧迫。
如图 S2 所示，在伸长率为 20% 时，MEA 在失效前可承受高达 5.5 N 的负荷。电路突破前最大伸长率下的杨氏模量（E）为 1.67 GPa。肌腱的杨氏模量约为 1 GPa，被迫拉伸肌肉的杨氏模量为 10 kPa(28)。通过扫描电子显微镜（SEM）不雅察金迹，在使用单轴负荷应变进行最大屈曲后，MEA 仍能导电，莫得发现款属开裂的迹象（图 1F）。
3.2 颐养成果
咱们细则了使用 MEA 安装刺激肌肉以防守变性肌肉萎缩和乙酰胆碱受体退化的颐养成果。在对五只 Lewis 大鼠的腓肠肌进行 1.5-3 厘米段的胫神经临界切除后，沿腓肠肌名义植入了五个 MEA 安装。对这五只动物进行了为期 14 天、每周五天、每天一小时的 500 mV、2 Hz 的 FES 无线刺激（图 2A）。术后 14 天对动物践诺安乐死并汇集肌肉。图 2B、2C 和表 S1 自满了肌肉纤维横截面积的颐养收尾。对三种情况进行了量化： 1）未使用 MEA 进行 FES（“去神经主管”）；2）使用 MEA 进行 FES 的去神经主管肌肉（“去神经主管 + MEA”）；3）未使用 FES 的好意思满神经（“对照组”）。肌纤维染色选择了血色素和伊红（H&E）以及梅森毛状体染色法（MTS）。诚然仍低于野生型对照组，但与未受刺激的去神经主管对照组比拟，经 MEA 处分的去神经主管肌肉的肌纤维横截面积如实有昭彰改善。与未经颐养的去神经主管动物比拟，经 MEA 介导的 FES 颐养动物的肌肉纤维平均面积增多了 160%（p < 0.05）。
咱们还测试了 MEA 介导的 FES 是否会导致乙酰胆碱受体的厚实，从而改善再神经主管。咱们用免疫组化方法（表 S2）对肌肉进行了分析，并使用α-孟加拉毒毒素（α-BTX）标识突触后烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）。与未处分组（“去神经主管 ”组）比拟，MEA介导的FES处分组的α-BTX染色颗粒面积昭彰增多（p < 0.05）（图2D）。
3.3 肌电图纪录
对于一个好意思满的系统，MEA 还必须通过产生肌电图 (EMG) 来监测受试者的规复情况。表皮电极必须监测肌肉行为，以细则适合的颐养方法。咱们试图筹商 MEA 在不同幅度的神经刺激下产生浅陋肌电图的纪录才略。
在一个动物模子中，坐骨神摄取到的刺激幅度束缚增多： 20毫安、40毫安和60毫安，脉冲宽度为200微秒。MEA 被植入腓肠肌背侧，以监测肌肉收缩。(图 3A）。如图 3B 所示，咱们不详了了地识别发出的三个主要脉冲序列，并细则信号振幅的互异。纪录轨迹自满，MEA 不详很好地纪录这些体内电信号。
四、筹商计划
功能性电刺激（FES）通过电刺激代替神经贯通规章，被临床用于颐养肌肉萎缩。通过喜跃-收缩耦合，逐日刺激决策可上调肌纤维的卵白质合成阶梯，下调卵白质降解阶梯，并影响肌肉细胞外基质的重塑。此外，FES 还能昭彰增多可用于 NMJ 形成的 AChR 簇的数目和大小。在临床环境中，肌内电极泛泛会因炎症反应龙套界面组织而失效。经皮电极可排斥电极穿透酿成的毁伤，但需要高电活水平，并可能导致无谓要的神经喜跃。因此，刻下还莫得在神经竖立经过中颐养肌肉神经主管萎缩的灵验方法。此外，对于神经再生的能源学、贯通再主管以及最好电刺激模式，还需要更多的信息。因此，仍然需要一种灵验、连气儿的接口，在不龙套组织的情况下改善对逊色经肌肉的刺激，并对神经再生进行及时体内监测。
本文报说念的多电极阵列集成了团聚物电极的柔韧性和分形图案金属电极的可拉伸性。该阵列的弹性特色与原生肌肉和肌腱磋商，确保了更好的机械顺应性。这项基础性职责解说了 MEA 制作的可行性，告成地防守了肌肉萎缩，并减少了周围神经毁伤后乙酰胆碱受体的蚀本。
为了达成一物两用的功能，MEA 的功能通过其纪录附肌行为的才略得到了进一步推广。通过将颐养上风与无线规章和遥测时刻结合起来，该时刻可达成及时更新的特定患者颐养方法。由于全面的枢纽性周围神经毁伤颐养必须允许轴突再生穿过神经缺损的长度到达肌肉并重新主管肌肉，因此 MEA 对去神经肌肉和乙酰胆碱受体防守的益处还不错与其他时刻结合起来，包括工程神经构建或神经导管。这种组合方法可能会增多告成再生到结尾器官的轴突数目，从而促进神经再生以及神经毁伤后的贯通和嗅觉功能规复。
本筹商存在一些局限性。在这项认识考证筹商中，该电极的收尾和纪录才略莫得与传统（非柔性）附膜电极进行比较。改日的一项筹商将包括顺利比较杨氏模量、张力加载后的阻抗、体内纪录才略以及异物关系炎症的遗传学和组织学标识，与莫得皮诺曲线图案的电极进行比较，并与刻下临床上使用的更坚韧的电极（如利弗莫尔、犹他 和密歇根电极阵列）进行比较。改日的职责要点是生物相容性和防守纤维囊的形成，以提升颐养成果和表皮纪录的准确性。为达成临床改换，还将进行耐受性和安全性筹商，打听在大鼠和包括猪在内的其他动物模子中的永远应用情况。
五、筹商论断
操纵半导体制造行业的灵感，咱们开发出了一种用于附乳头植入的柔性电极阵列。与之前态状的电极不同，这里陈说的认识考证多电极阵列将团聚物电极的机动性与分形图案金属迹线结合在通盘。为了防守纤维化关系问题，在制造经过中使用了聚酰亚胺和金等生物相容性材料。阵列的弹性特色与原生肌肉和肌腱磋商，确保了更好的机械顺应性。咱们的主邀功能主见是在神经再生经过中保握肌肉力量，以便更快地从毁伤中康复。在啮齿动物周围神经毁伤模子中，这种阵列告成地减少了肌肉萎缩，并松开了周围神经毁伤时期神经肌肉接头的蚀本。与未经颐养的去神经主管动物比拟，使用 MEA 介导的 FES 的去神经主管动物的肌肉纤维和神经肌肉接头面积昭彰增多。此外，该电极还能纪录附肌电行为，从而进一步推广了其功能。笔据刺激决策，MEA 的肌电图纪录可捕捉到腓肠肌收缩的强度和频率。从咱们的筹商收尾来看，该开辟的颐养和会诊才略在体内皆自满出了精致的出路。有了这种双重功能的电极，咱们当今就不错应用颐养性电刺激决策，并及时监测规复经过。
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